細胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。細胞復(fù)蘇是一簡單的試驗操作，但操作中有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小問題，才能使復(fù)蘇后的細胞狀態(tài)保持良好，針對細胞復(fù)蘇，1. 可以提前把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時到1小時； 2. 為防止凍存管在升溫時爆裂等，可以在放入水浴前就實現(xiàn)在超凈臺里把蓋子擰松一下然后再擰上； 3. 水浴溫度40℃應(yīng)該也沒問題，但正規(guī)的protocol上從來都只說37℃。
一、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時， 1~2 ℃/min；
當(dāng)溫度達-25 ℃以下時， 5~10 ℃/min；
當(dāng)溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。
2. 簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽長期儲存。
三、低溫保護劑的應(yīng)用
在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
四、細胞凍存方法
1. 預(yù)先配制凍存液
（1）10%DMSO + 細胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
（2）10%甘油+ 細胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
2. 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細胞/ml）。
3. 加入1 ml細胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。
五、保存細胞的復(fù)蘇方法
1. 快速解凍
凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。
2. 解凍后的細胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。
3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感
解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
在線咨詢