根據(jù)個(gè)人的試驗(yàn)經(jīng)歷，我們都或多或少把握了一些小技巧。zui終的試驗(yàn)成果是受整個(gè)操作進(jìn)程及試劑本身影響的，所系還要多學(xué)習(xí)，多參看，讓試驗(yàn)成果更加。ELISA檢測(cè)體系是免疫學(xué)反應(yīng)應(yīng)用到生產(chǎn)中zui為活絡(luò)的技術(shù)手段，有著十分重要的效果。下面是上海酶聯(lián)生物專家對(duì)的經(jīng)歷講談：
一、試驗(yàn)包被液的選擇
一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時(shí)因?yàn)樵囼?yàn)的需要，包被原的特殊性也或許選用中性的緩沖溶液來包。應(yīng)留意以下原理：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的效果，這種物理吸附對(duì)錯(cuò)特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)一般含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗(yàn)還要有鞏固的理論外也要實(shí)踐，看一下zui終可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
二、包被原的性質(zhì)很重要
蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其辨認(rèn)，所以保存抗原很重要，我做重組蛋白時(shí)，師兄都嚴(yán)格正告我必定要在冰浴下緩慢消融便是這個(gè)道理。還有有的包被原或許不是蛋白，關(guān)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對(duì)其改造再加以包被。
1.親和素生物素：先親和素先包被載體，參與生物素化的DNA，這種包被辦法均勻、健壯，已擴(kuò)展應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。
2.脂類物質(zhì)：可將其在有機(jī)溶劑中溶解后參與Elisa板孔中，開蓋置冰箱或涼風(fēng)吹干，待酒精蒸騰后，讓脂質(zhì)天然干固在固相表面。
3.小分子必須依托和大的蛋白載體偶聯(lián)后才華固定在固相載體上。
三、封閉
繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的進(jìn)程。封閉便是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空地，然后排擠Elisa后的過程中攪擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用(5%-10%)；還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清(首要為了掃除類似蛋白攪擾)和酪蛋白等等。但zui終選用什么，要依據(jù)試驗(yàn)具體來實(shí)踐。
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